باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) بیمارگر مخربی است که دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی می­باشد به­طوریکه به بیش از 180 گونه گیاهی حمله می­کند. مهمترین میزبان­های این بیمارگر درختان میوه هسته­دار، درختان میوه دانه­دار و گیاهان علفی می­باشد. به علت هم-تکاملی با بیمارگرها، گیاهان چندین مکانیسم دفاعی را برای حفاظت از خودشان ایجاد نموده اند. تجمع پروتئین های مرتبط با بیماریزایی مانند PR1, LOX2, PDF1.2و VSP2 یکی از مکانیسم های مقاومت گیاه به بیمارگر است. ایجاد گیاهان مقاوم، یکی از مهمترین استراتژی ها در مدیریت بیماری در محصولات زراعی و درختان میوه مختلف است. تشخیص مکانیسم های درگیر در پاسخ های گیاهان علیه بیمارگرها، می تواند تولید ارقام مقاوم را تسهیل کند و در این راستا، تشخیص ژن های درگیر در مقاومت گیاه میزبان می تواند گام سودمندی در توسعه ارقام مقاوم باشد. هدف از تحقیق حاضر بررسی الگوی تغییر بیان ژن PR1 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید و محدود کننده بیمارگرهای بیوتروف)، و ژن های LOX2, PDF1.2 و VSP2 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید محدود کننده بیمارگرهای نکروتروف و حشرات گیاهخوار)، در گیاه آرابیدوپسیس مایه زنی شده به Pss و در دو فاز مختلف رویشی و زایشی بود. نمونه های گیاه آرابیدوپسیس در زمان های 0، 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی جمع آوری شد و میزان جمعیت باکتری Pss در سطح گیاه نیز در این زمان­ها مورد بررسی قرار گرفت. سپس RNA کل استخراج شد و سنتز cDNA و تغییرات بیان چهار ژن با استفاده از روش Real time RT-PCR سنجیده شد. نتایج کلی نشان داد که گیاهان آرابیدوپسیس از مسیر دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید برای مقاومت به باکتری Pss استفاده نموده است و این که در فاز زایشی نسبت به فاز رویشی این مقاومت بیشتر می باشد. همچنین همکنش بین دو مسیر دفاعی وابسته به SA و JA نیز به اثبات رسید. کلمات کلیدی: مقاومت سیستمیک اکتسابی، مقاومت سیستمیک القایی، بیان ژن، پروتئین های مرتبط با بیماریزایی    

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه فصل اول 1 1-1- مقدمه 2 1-2- اهداف 3 فصل دوم: پیشینه پژوهش 5 2-1- خصوصیات کلی Pss 6 2-1-1- موقعیت تاکسونومیکی 6 2-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss 7 2-1-3- دامنه میزبانی 7 2-1-4- بیماریزایی P. syringae 8 2-2- آرابیدوپسیس 9 2-3- واکنش Real-time RT-PCR 10 2-3-1- بیان ژن (Gen Expression) 11 2-4- دفاع در گیاهان 11 2-4-1- مقاومت ساختاری و القایی 12 2-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Systemic Aquired Resistance (SAR) 14 2-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Systemic Resistance (ISR) 17 2-4-4- پاسخ دفاعی 18 2-4-5- سیگنال های موجود در مقاومت به بیماری های گیاهی 18 2-4-6- تشخیص الیسیتورهای باکتریایی توسط سلول های گیاهی 21 2-4-7- همکنش گیاه- Pseudomonas syringae 24 2-4-8- تغییرات در سطح سلول 26 2-5- نقش دفاعی هورمون ها در گیاهان 27 2-5-1- هورمون سالیسیلیک اسید 29 2-5-2- هورمون جاسمونیک اسید 29 2-5-3- هورمون اتیلن 29 2-5-4- هورمون آبسیزیک اسید 30 2-5-5- هورمون اکسین 31 2-6- همکنش مسیر های هورمونی (Cross-talk) 32 2-6-1- اثر آنتاگونیستی SA بر سیگنالینگ JA 36 2-7- القاگرهای شیمیایی دفاعی در گیاهان 37 2-8- بررسی تعدادی از ژن های مرتبط با دفاع در گیاهان 38 2-8-1- ژن PDF1.2 38 2-8-2- ژن VSP2 38 2-8-3- ژن LOX2 39 2-8-4- ژن PR1 40 2-9- ملاحظات 40 فصل سوم: مواد و روش ها 42 3-1- تهیه باکتری Pss 43 3-1-1- خالص سازی باکتری 43 3-1-2- آزمون تولید لوان 43 3-1-3- آزمون تولید رنگ فلورسنت 44 3-1-4- آزمون اکسیداز 44 3-1-5- آزمون واکنش فوق حساسیت (HR) 44 3-1-6- اثبات بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی 44 3-1-7- آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) 45 3-2- کاشت گیاه آرابیدوپسیس 47 3-2-1- محیط کشت آرابیدوپسیس 47 3-2-2- شرایط گلخانه 48 3-2-3- مایه زنی با Pss 49 3-2-4- نمونه برداری 49 3-3- بررسی میزان جمعیت باکتری Pss 50 3-4- استخراج DNA 51 3-4-1- طرز تهیه بافر CTAB 52 3-4-2- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل 52 3-5- استخراج RNA از بافت 52 3-5-1-تهیه آب تیمار شده با DEPC 53 3-5-2- تعیین کمیت و كیفیتRNA 54 3-5-3- تیمار DNase 54 3-5-4- توقف تیمار DNase 54 3-5-5- سنتز رشته اول cDNA با استفاده از RNA استخراج شده 55 3-5-6- تکثیر قطعه مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز 56 3-5-7- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها 57 3-6- واكنش Real-time RT-PCR (Relative) 57 3-6-1- واكنش Real-time RT-PCRژن های مقاومت و ژن كنترل داخلی 58 3-6-2- روش نرمال سازی نسبی بیان ژن ها 59 3-6-3-آنالیز آماری بیان ژن ها 59 فصل چهارم: نتایج 60 4-1- آزمون های تشخیصی اولیه 61 4-1-1- استفاده از PCR جهت تشخیص Pss 62 4-2- بررسی جمعیت باکتری پس از مایه زنی 62 4-3- استخراج Total RNA از بافت گیاه 64 4-3-1- تعیین کیفیت Total RNA 64 4-3-2- تعیین غلظت Total RNA با استفاده از نانودراپ 64 4-3-3- تیمار DNase 65 4-3-4- بررسی صحت سنتز cDNA 66 4-5- بررسی بیان ژن ها 66 4-5-1- ژن PR1 67 4-5-2- ژن VSP2 68 4-5-3- ژن PDF1.2 70 4-5-4- ژن LOX2 71 4-5-5- الگوی بیان ژن ها در دو فاز مختلف رویشی و زایشی گیاهان آرابیدوپسیس 73 فصل پنجم: بحث 75 5-1- بحث 76 5-2- بررسی دفاع ذاتی وابسته به هورمون های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید 77 5-3- آنالیز مقایسه ای تغییرات بیان ژن ها 79 3-۵-1- بررسی پاسخ ژن PR1 علیه Pss 79 3-۵-2- بررسی پاسخ ژن PDF1.2 علیه Pss 81 5-3-3- بررسی پاسخ ژن LOX2 علیه Pss 82 3-۵-4- بررسی پاسخ ژنVSP2 علیه Pss 83 5-4- تعیین جمعیت باکتری 84 5-5- نتیجه گیری نهایی 85 5-5-1- دو فرضیه احتمالی برای بیان مسیر وابسته به JA بلافاصله بعد از مسیر وابسته به SA 86 پیشنهادات 90 منابع 91          

فهرست شکل ها

عنوان                               صفحه شکل 3-1- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک 49 شکل 4-1- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی 61 شکل 4-2- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با استفاده از جفت آغازگرهای B2 و B1 62 شکل 4-3- بررسی جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف رویشی و زایشی 63 شکل 4-4- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها 64 شکل 4-5- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با استفاده از نانودراپ 65 شکل 4-6- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase 65 شکل 4-7- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA 66 شکل 4-8-تغییرات بیان ژن PR1 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 68 شکل 4-9- تغییرات بیان ژن VSP2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 69 شکل 4-10-تغییرات بیان ژن PDF1.2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 71 شکل 4-11-تغییرات بیان ژن LOX2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 72 شکل 4-12- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز رویشی گیاهان 74 شکل 4-13- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز زایشی گیاهان 74

فهرست جداول

عنوان                                           صفحه جدول 3-1- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام واکنش 25 میکرولیتری PCR جهت تشخیص Pss 45 جدول 3-2- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیص Pss 46 جدول3-3- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند 48 جدول 3-4- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه 100 میلی لیتر بافر CTAB 52 جدول 3-5- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase 54 جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله اول 55 جدول 3-7- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم 55 جدول 3-8- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام یک واکنش 20 میکرولیتری PCR 56 جدول 3- 9- سیکل دمایی PCR با آغازگر ef1-α 56 جدول 3-10- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها 57 جدول 3-11- سیكل دمایی مورد استفاده در واكنش Real-time RT-PCR 58 جدول3-12- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واكنش 20 میکرولیتری Real-time RT-PCR برای ژن های اصلی و كنترلی داخلی 58 جدول 4-1- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی 63 جدول 4-2- مقایسه میانگین بیان ژن PR1 67 جدول 4-3- مقایسه میانگین بیان ژن VSP2 68 جدول 4-4- مقایسه میانگین بیان ژن PDF1.2 70 جدول 4-5- مقایسه میانگین بیان ژن LOX2 71

فصل اول

1-1- مقدمه

یکی از مهمترین عوامل بیماریزا در گیاهان باکتری های وابسته به جنس Pseudomonas هستند. این گروه از باکتری ها جزو مهمترین بیمارگرهای گیاهی بوده که نقش عمده ای در پایین آوردن کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی داشته و دارای گسترش جهانی نیز می باشند، و بیماری هایی از قبیل لکه برگی، بلایت، پژمردگی آوندی، پوسیدگی نرم، شانکر و گال در گیاهان مختلف ایجاد می کنند. یکی از بیماری های مهمی که توسط باکتری های این گروه ایجاد می شود شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار می باشد که توسط Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) ایجاد می شود و یکی از معضلات کشاورزان در سراسر جهان به شمار می رود .(Vicente et al., 2004) این بیماری خسارت زیادی وارد می سازد و سبب خشک شدن نهال ها و درختان جوان، کاهش محصول در درختان مسن و گاهی خشکیدگی جوانه ها و گل های درختان بیمار می شود و معمولاً در باغ های جوان موجب نابودی درختان به میزان 10 تا 75 درصد می شود (Agrios, 2005). باکتری عامل بیماری شانکر اولین بار از یاس جداسازی و در سال 1902 به این نام نامگذاری شد (Hirano and Upper, 2000). در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی از درختان زردآلو در اصفهان گزارش و میزان خسارت ناشی از آن 22 تا 50 درصد ذکر گردید (بهار و همکاران، 1361).